RNAEx ZOL总RNA提取试剂
    发布时间: 2023-07-21 10:51    

RNAEx ZOL Reagent   

货号:EK-5301-200ml

中文名称:RNAEx ZOL RNA提取试剂(同Thermo的Trizol)
应用:RNA提取
运输条件:常温运输

【保存条件】

4ºC 避光保存一年

【概述】

RNAEx ZOL Reagent 是即用型细胞和组织总 RNA 提取试剂,该试剂是一步法苯酚和异硫氰酸胍解决方案。该试剂可保持样品 RNA 的完整性,同时破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分享成水相和有机相。RNA 存于水相,通过异丙醇沉淀回收。

此方法可完美应用于少量人类、动物、植物或细菌来源的组织和细胞,允许大量样本同时处理。整个过程可在一小时内完成,同时可避免蛋白质和 DNA 污染。

【操作方法】

1. 样品处理:

a. 组织:将组织在液氮中研磨,磨碎后及时于每 50-100mg 组织中加入 1ml RNAEx ZOL Reagent,样品体积不应超过 RNAEx ZOL Reagent 体积的 10%(或使用匀浆仪器)。

b. 单层细胞:直接在培养皿中裂解细胞,如35mm直径的培养皿中加入1ml RNAEx ZOL Reagent,使用吸头吹匀促进细胞裂解。RNAEx ZOL Reagent 的试剂量基于培养的表面积而不是细胞数量(每 1cm2加入 1ml RNAEx ZOL Reagent), RNAEx ZOL Reagent试剂量不足可能会导致分离出的 RNA 有 DNA 污染。

c. 悬浮细胞:先低速离心沉淀细胞,弃培养液后加入 RNAEx ZOL Reagen(t 1ml RNAExZOL Reagent 加入至 5×106动物、植物、酵母或细菌细胞中)。加入 RNAEx ZOL Reagent 前避免洗涤细胞,这容易导致 mRNA 降解。一些酵母和细菌细胞的裂解可能需要使用均质器。

可选:一些样品可能需要额外的分享步骤,这些样品蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高,如肌肉、脂肪组织、以及部分植物块茎。在根据上述方式处理后,于2-8°C,12000g 离心 10 分钟,移除沉淀不溶物,RNA 存于上清中。

2. 相分离

a. 将加完 RNAEx ZOL Reagent 后的样品在室温(15-30°C)静置 5 分钟,以利于样品核蛋白体完全分离

b. 按每 1ml RNAEx ZOL Reagent 加入 0.2ml 氯仿(自备),小心盖好样品管后,剧烈震荡 15 秒,后置于室温(15-30°C)静置 2-3 分钟。

c. 2-8°C,10000g 离心 15 分钟。离心后,混合物分离为下层(酚-氯仿相)、中间相以及上层无色水相。RNA 存在于上层无色水相中,体积约为*初加入 RNAEx ZOL Reagent 体积的 60%左右。

RNA 分离提取步骤:

1. RNA 沉淀

a. 将上述水相转移到一个新的管中,并保存有机相(若希望分离 DNA 或蛋白质)。混合异丙醇从水相中沉淀 RNA,每 1ml 用于初始裂解的 RNAEx ZOL Reagent 使用 0.5ml 异丙醇,室温(15-30°C)静置 10 分钟。

b. 2-8°C,10000g 离心 10 分钟。离心前看不出 RNA 沉淀,离心后在管侧和管底会出现胶状沉淀即为 RNA 沉淀。

2. RNA 洗涤

a. 弃上清。用 75%乙醇洗涤 RNA 沉淀一次,每毫升用于初始裂解的 RNAEx ZOL Reagent 试剂使用至少 1ml 75%乙醇,涡旋混匀后于 2-8°C,不超过 7500g 离心 5 分钟,弃上清

3. 溶解 RNA

a. 在上述过程结束后,简单干燥 RNA 沉淀(空气干燥或真空干燥 5-10 分钟,不要真空离心离心干燥 RNA)。重要的是不要让 RNA 沉淀过于干燥,这将大大降低其溶解度。加入 25-200μl 无 RNase 水或 0.5% SDS,用吸头吹打几次至溶解,于 50-60°C 放置 10 分钟使 RNA 彻底溶解(注:若后续进行酶学实验,请勿使用 0.5% SDS 溶液溶

解)。溶解后置于-80°C 保存。

DNA 分离提取步骤:

1. DNA 沉淀

a. 样品加入氯仿分层后,移去上层水相提取 RNA,吸取中间层和有机层的 DNA 用乙醇沉淀。每使用 1ml RNAEx ZOL Reagent 加入 0.3ml 无水乙醇混匀,室温静置 2-3 分钟,2-8°C 不超过 2000g 离心 5 分钟以沉淀 DNA。

2. DNA 洗涤

a. 移去苯酚-乙醇上清液(如需要,保存上清用于蛋白质分离,操作见下)。用 0.1M 的柠檬酸钠溶液(溶于 10%乙醇的柠檬酸钠溶液)清洗沉淀的 DNA。每毫升用于初始的 RNAEx ZOL Reagent 试剂添加 1ml 溶液。每次清洗时,室温静置 30 分钟 DNA沉淀(间歇混匀),2-8°C 2000g 离心 5 分钟,弃上清。重复一次。

b. 用 75%乙醇再洗一遍 DNA 沉淀,每使用 1ml RNAEx ZOL Reagent 加入 1.5-2ml 75%乙醇,室温放置 10-20 分钟(间歇混匀),2-8°C 2000g 离心 5 分钟,弃上清。

c. 室温放置晾干 DNA 5-15 分钟,用 8mM NaOH 溶解 DNA。从 50-70mg 组织或 107细胞中分离的 DNA 溶于 300-600μl 8mM 的 NaOH 溶液中,浓度常为 0.2-0.3μg/μl。

注:提取的 DNA 沉淀不易溶于水和 Tris 缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mM NaOH 的 pH值为 9,NaOH 溶液溶解后可用 TE、HEPES 调节 PH。从某些样品(尤其是组织)中提取的 DNA 中可能包含一些胶状不溶物可用>12000g 离心 10 分钟除去。

蛋白质分离操作步骤:

1. 蛋白质沉淀

a. 苯酚-乙醇上清液(每 1ml RNAEx ZOL Reagent 试剂上清体积约 0.8ml)中加入异丙醇可沉淀出蛋白质。每毫升用于初始裂解 RNAEx ZOL Reagent 试剂中添加 1.5ml 异丙醇,室温静置 10 分钟,然后 2-8°C 12000g 离心 10 分钟以沉淀蛋白质,弃上清。

2. 蛋白质洗涤

a. 用 0.3M 盐酸胍溶液(溶于 95%乙醇)洗涤蛋白质沉淀 3 次。每毫升每毫升用于初始裂解 RNAEx ZOL Reagent 试剂中添加 2ml 0.3M 盐酸胍溶液。每次洗涤中,室温静置 20 分钟,2-8°C 7500g 离心 5 分钟,弃上清,重复 3 次。*后清洗后,加入 2ml 无水乙醇,漩涡混匀蛋白沉淀,室温静置 20 分钟,然后 2-8°C 7500g 离心 5 分钟以沉淀蛋白质,弃上清。

3. 蛋白质溶解

a. 干空干燥蛋白质沉淀 5-10 分钟,用 1% SDS 溶解蛋白质,反复吹打,50°C 温浴至完全溶解,不溶物 2-8°C 10000g 离心 10 分钟去除。分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot 或者-20°C 保存(长期保存建议-80°C)

1. RNA 酶污染注意事项:

a. 提取过程用品均经过去 RNA 酶处理:玻璃制品可以 150 °C 烘烤 4 小时 ,塑料制品可浸泡于 0.5M NaOH 溶液后用清水冲洗并高压灭菌,吸头及离心管类尽量使用一次性无酶吸头及离心管

b. 佩戴手套及口罩及护目镜:皮肤上常含有细菌和霉菌,可污染 RNA 制备,且同时是RNA 酶来源,同时 RNAEx ZOL Reagent 对皮肤有一定毒性,建议佩戴手套及口罩及护目镜。

c. 尽量于通风橱内提取:避免吸入提取过程中有毒物质。

2. 安全性问题:

a. 本品在与皮肤接触及吞咽有毒性,可导致烧伤。与皮肤接触后,应立即用洗涤剂和大量水冲洗。如感到身体不适,应立即就医

3. 存储性问题:

a. 实验已证明 RNAEx ZOL Reagent 室温下可稳定保存 12 个月,不过依然建议储存于2-8°C 以保证*佳性能,尽量避光保存。



RNAEx ZOL总RNA提取试剂